Zu den Schwerpunkten der Sammlung der Neuen Galerie gehört die Malerei des 19. Jahrhunderts mit bedeutenden Exponaten besonders zur Entwicklung der Landschaftsmalerei. Gemälde von Johann Martin von Rohden, von spätromantischen Malern wie Johann Wilhelm Schirmer sowie von Künstlern der Willingshäuser Malerschule sind hier vertreten. Am Übergang zum 20. Jahrhundert sind besonders die umfangreichen Bestände der einzigen deutschen Neoimpressionisten Paul Baum und Curt Herrmann hervorzuheben, die sich früh mit den Errungenschaften des französischen Impressionismus auseinandergesetzt hatten.
Zu den Höhepunkten in der Neuen Galerie zählen die Werke von Lovis Corinth, besonders seine virtuose Walchenseelandschaft von 1924. Die Klassische Moderne ist mit Werken u. a. von Alexej von Jawlensky, Henri Laurens, Max Ernst und Conrad Felixmüller vertreten. Malerei und Skulptur der Nachkriegszeit, der 1950er und 1960er Jahre, Pop Art und abstrakte Malerei bis hin zur zeitgenössischen Kunst bilden weitere Schwerpunkte des Hauses. Dazu gehört neben Werken von Gerhard Richter, Sigmar Polke, Wolf Vostell oder der Quadriga auch die ungegenständliche, monochrome Malerei.
In der zeitgenössischen Sammlung verdienen die Erwerbungen der weltweit renommierten documenta-Ausstellungen besondere Aufmerksamkeit. Dazu gehören u. a. der „Kasseler Raum — Ferne Zwecke“ (1998) von Ulrike Grossarth, die Installation „THOU-LESS“ (2002) von Doris Salcedo und Romuald Hazoumés „Dream“ (2007).
Herzstück der Neuen Galerie ist der anlässlich der Eröffnung des Hauses 1976 von Joseph Beuys persönlich eingerichtete Raum im Erdgeschoss.
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